时隔3年后,韩春雨发布最新科研成果论文

时隔3年,曾处于舆论旋涡的韩春雨公开了一项最新研究成果。

近日,韩春雨在预印本网站BioRxiv上发表了一篇关于基因编辑的新文章:Background free tracking of single RNA in living cells using catalytically inactive CasE。

文章共有5名作者,依次为Feng Gao, Yue Sun, Feng Jiang, Xiaoyue Bai, Chunyu Han,工作单位均为河北科技大学基因编辑研究中心。其中,韩春雨为通讯作者。

据了解,论文中提到的CasE是Ⅰ-E型 CRISPR复合物的核心成分,它通过结合特定的茎环区域单独处理pre-crRNA,称之为 CasE Binding S,简称为CBS。CasE保守His20参与催化活性,ΔHis26-TtCse3突变的CasE(dCasE)则失去了催化活性,但仍然与其靶标紧密结合。

在该研究中,通过将 split 荧光与dCasE的N端和C-末端(ΔHis20)融合,构建了活体RNA跟踪工具VN-dCasE-VC。该系统仅在存在靶RNA时才发出荧光,从而增强信噪比。

在活细胞中进行可视化的RNA追踪,不需要特定的亚细胞分布。CasE-GFP和dCasE-GFP在HEK293T细胞中的高水平表达和均匀分布表明CasE和dCasE适合于活细胞中的RNA操作。

为了测试CasE在哺乳动物细胞中表达时是否具有强活性,作者构建了“关闭”报告基因质粒CBS-GFP-N1。它由5′-UTR中的GFP mRNA和CasE结合位点(CBS)组成。当CasE被引入系统时,GFP表达水平急剧下降。

同时,为了进一步测试CasE活性,作者还构建了“开启”报告基因质粒RED-16×CBS-Lin28-C1,其中CBS插入RED单体基因的3′-UTR区和Lin28的上游。Lin28是RNA核保留信号,在其3′-UTR中具有lin28信号的RED单体mRNA几乎不能翻译成蛋白质。

CBS-CasE依赖限制性切断lin28信号并从核释放靶mRNA用于翻译(图1E和图1F)。这些表明CasE可以结合并切割哺乳动物细胞中的CBS。

另外,为了将dCasE-CBS相互作用设计到RNA追踪系统中,作者通过将split-FP5-7与dCasE蛋白结合。发现一个版本,即VN-dCasE-VC很难发出荧光,这可能是由于不正确的折叠或不稳定的状态,但是当与靶RNA(CBS)结合时,可以在荧光显微镜下清楚地捕获荧光信号,即使VN-dCasE-VC表达质粒的转染剂量非常低。

接下来,作者使用VN-dCasE-VC系统追踪哺乳动物细胞中过表达的β-肌动蛋白(β-Actin)的mRNA,VN-dCasE-VC系统在细胞质中显示出强荧光。此外还观察到,向靶mRNA添加更多CBS可改善信号,荧光追踪更清晰,因此,可以通过增加CBS的数量来检测低丰度的mRNA。

总的来说,韩春雨团队发明了一种新的RNA追踪工具,将其命名为VN-dCasE-VC,该系统能够追踪活细胞中没有背景的特定RNA,通过荧光将其可视化。

目前已有两种活细胞RNA追踪成像工具,一种是MS2,一种是Cas13a,韩春雨团队开发的dCasE系统,成像效果由于MS2,而且,dCasE蛋白的分子量为22kDa,远小于Cas13a的130kDa,dCasE的小分子量更容易递送至细胞内,因此更适合用于活细胞的RNA追踪。

一位接近韩春雨的人士透露:“这篇文章是此前韩春雨工作的延续,目的都是开发基因编辑工具。”

不过,值得注意的是,该研究目前发表于预印本网站,尚未经过同行评议,

对此,有科研人士指出,首发在未经同行评议的预印本上,是为了获得首发权。“韩春雨下一步还会投正式期刊的。”前述人士推测。

不知道此次新的研究成果是否会再次给韩春雨带来关注,2016年5月,《自然—生物技术》发表韩春雨团队新的基因编辑技术NgAgo,被媒体以“甘坐冷板凳、十年憋大招”的故事原型炒作而走红,此后半年,韩春雨个人及其所在大学陆续获得各类名誉和大量经费资助,但亦有国内多名基因编辑领域科学家实名发声称实验结果难以重复,怀疑实验结果的真实性。

2017年8月,《自然—生物技术》发表题为《是该数据说话的时候了》社论,宣布撤回韩春雨团队于2016年5月2日发表在该期刊的论文。

2018年9月,河北科技大学发布公告,韩春雨团队不存在主观造假。但依据有关规定,取消韩春雨所获得的荣誉称号,终止韩春雨团队承担的科研项目并收回科研经费。

韩春雨团队回应称,实验设计存在缺陷、研究过程存在着不严谨的问题。

有业界人士表示:“这波之后,NgAgo这个研究方向在中国做得很慢。韩春雨他们的工作开展起来也比较困难,连学生也没有新招。”

附韩春雨论文链接:

https://www.biorxiv.org/content/biorxiv/early/2019/05/13/635912.full.pdf

来源:生物世界 中国科学报 医谷综合

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